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炎症在角叉菜胶诱导的慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型中的作用

期刊：ann transl med

影响因子：5.746

发表时间：2020年4月

 

01 研究背景与意义

背景：慢性血栓栓塞性肺动脉高压 (CTEPH) 是一种发病率和死亡率较高的疾病，由肺动脉的血栓和阻塞性重塑引起，是一种独特形式的肺动脉高压 (PH)。

它的特点是血栓溶解不完全，促进了进行性肺血管阻塞和肺血管重塑，随后肺血管阻力 (PVR) 的慢性增加，导致肺动脉压力升高和右心室 (RV) 肥厚，最终导致 RV 衰竭甚至死亡。尽管 CTEPH 的现代治疗在外科和药物治疗方面都取得了重大进展，但没有人能够声称可以治愈该疾病，这主要是因为我们对该疾病的潜在发病机制了解有限，并且缺乏可靠的 CTEPH 动物模型可供研究。

最近，炎症已被认为是各种风险因素触发静脉血栓栓塞 (VTE) 形成的常见途径，我们研究了一种新的 CTEPH 小鼠模型，该模型再现了频繁的触发并类似于时间进程、组织学特征和临床表现人类 CTEPH 的研究，开启了 CTEPH 炎症的新视野。

目前对于CTEPH的对策：肺动脉内膜切除术 (PEA) 的出现，曾经被认为是该病的最佳治疗方法，然而，相关比例的患者（从 5% 到 35%）在 PEA 后出现持续的小血管病变，并且许多受影响的个体不适合 PEA。对于某些人来说，手术无法触及阻塞物，而其他人可能有严重的合并症或高龄，并且大量患者选择不进行 PEA 。

研究意义：因此，为了提高生活质量并最终提高 CTEPH 患者的生存率，迫切需要额外的或替代的非手术治疗。
 

02 研究内容

方法：

1、构建CTEPH 动物模型：通过给 8 周大的雄性 Sprague Dawley (SD) 大鼠实施肺栓塞 (PE) 方案（包括 3 次连续左颈静脉静脉注射自体血凝块），使用氨甲环酸 (200 mg/kg.d) 抑制纤溶，并注射额外的角叉菜胶（20 mg/kg，每周一次）以产生血管周围炎症。

2、通过监测平均肺动脉压（mPAP）和组织病理学变化来评估CTEPH模型。

3、通过检测各组中的RT-PCR、蛋白质印迹、TUNEL和免疫组化，发现炎症的潜在机制可能在肺血管重塑中起作用。


 

03 模型构建

 

动物分组：80只SD大鼠随机分为以下四组（n=20）：

①生理盐水（NS）对照组

②角叉菜胶对照组 

③肺栓塞 (PE)组A 

④肺栓塞 (PE)组B

将 30 只 SD 大鼠随机分为 5 个亚组，探讨角叉菜胶对 CTEPH 的影响。
 

I.对照组 

II.第一次栓塞后一周 

III.第二次栓塞后一周 

IV.第三次栓塞后一周 

V.第三次栓塞后三周

 

自体血凝块的制备

 

自体血凝块制备

在栓塞前一天，使用毛细玻璃管从麻醉后的眼眶静脉收集血液，并在4℃下置于无菌培养皿中过夜。凝块从带有 NS 的毛细玻璃管中冲出，然后在栓塞当天修剪成 1.1×3 mm 的凝块（图 1）

 

 

自体血凝块栓塞过程

 

建模 CTEPH

大鼠用 10% 水合氯醛 (0.3 mL/100 g) 麻醉，在无菌条件下，暴露左颈外静脉。然后，将制备好的血凝块（每只动物 32±5）以 0.5 mL/min 的速度注入左颈静脉（图 2）


动物处理：

手术前对大鼠称重并麻醉（10%水合氯醛0.3 mL/100 g）。在第 1、4 和 11 天通过左颈外静脉以每只动物 32±5 的剂量连续注射 3 次自体血凝块进行肺栓塞。

对照动物接受相同的方案，但用盐水溶液代替血栓形成材料处理。腹腔注射氨甲环酸 (200 mg/kg) 可抑制内源性纤维蛋白溶解。

此外，PE B组和角叉菜胶对照组在PE后腹腔注射0.2%卡拉胶（20 mg/kg，每周一次），为预防感染，随后肌肉注射青霉素（10,000 U/kg/day）3天。安乐死后，在水合氯醛麻醉下收集器官和血浆。

取材：

① 取血：收集并离心得到血清；血清保持在-80℃用于后续ELISA。

② 整块切除肺，修剪结缔组织，用10%甲醛灌注肺叶，并在10%甲醛溶液中继续固定过，用于后续病理检测。

③ 取冻存肺组织和肺动脉用于pcr和wb检测。

取材后续检测：

1.HE染色 

2.免疫组化检测 

3.TUNEL试剂盒检测肺动脉内皮细胞凋亡 

4.PCR检测: TNF-α、NF-κB 和 B 细胞淋巴瘤-2 (BCL-2)、 BAX

5.WB检测：TNF-α、抗 NF-κB (p65)、抗 BCL-2 和抗 BAX 抗体

 

(A) 隔离右颈外静脉并连接压力传感器(A, 白色箭头);

(B) 记录肺动脉压 (B, 红色箭头)。 

mPAP，平均肺动脉压。

蓝色箭头：自体血凝块；

红色箭头：继发性血栓形成或新血栓。

 

四组第二次栓塞后1周（S）和第三次栓塞后3周（T）的病理变化；

1、生理盐水对照组；

2、角叉菜胶对照组；

3、PE A组；

4、PE B组

第二次栓塞后一周（S）和第三次栓塞后三周（T）的病理变化。  

(A) 通过 TUNEL 检测内皮细胞凋亡。

(B)免疫组化检测凝血因子VIII的表达。

 

04 数据分析

大鼠 CTEPH 模型中 mPAP 和 WA/TA 比值变化；mPAP所示，PE组在第3次栓塞后3周反复栓塞后WA/TA比值逐渐增加（P<0.05），但对照组无变化（P>0.05）。


内皮细胞凋亡指数及内皮标志物VIII因子OD率；栓塞次数和栓塞后时间表明TUNEL逐渐降低，而内皮标志物VIII因子的表达则呈相反趋势。


不同亚组的mRNA表达；TNF-α、NF-κB/p65 和 BCL-2 水平升高，如栓塞次数和栓塞后时间所示，而 BAX mRNAs 表达呈相反趋势。


不同亚组大鼠的 mRNA 水平。TNF-α、NF-κB/p65、BCL-2随着栓塞次数和栓塞时间的增加而增加，而BAX mRNAs的表达则相反。


不同亚组表达的蛋白质；TNF-α、NF-κB/p65 和 BCL-2 水平升高，如栓塞次数和栓塞后时间所示，而 BAX  表达呈相反趋势。


不同亚组的蛋白质水平。TNF-α、NF-κB/p65、BCL-2水平随栓塞次数和栓塞时间增加而升高，而BAX蛋白表达呈相反趋势。
 

04 总结

结果：

1、在本研究中，与对照大鼠相比，CTEPH 大鼠表现出明显的肺血管重塑，血管壁面积/总面积 (WA/TA) 比值更高（85.41%±7.37% vs. 76.41%±5.97%，P< 0.05）。

2、在仅注射凝块的大鼠和注射凝块和角叉菜胶的大鼠之间观察到平均肺动脉压 (mPAP) 值的显着差异（分别为 25.51±1.13 与 29.82±1.26 mmHg，P < 0.05）。

3、在第三次栓塞后，肺动脉出现血栓和内膜增生。

4、反复栓塞可提高肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、NF-κB/p65 和 B 细胞淋巴瘤-2 (BCL-2) 的 mRNA 和蛋白质水平，但降低 BAX的 表达。

结论：
利用炎症触发静脉血栓栓塞症(VTE)形成，我们成功构建了CTEPH动物模型。炎症可能通过抑制内皮细胞凋亡在 CTEPH 的发病机制和进展中起关键作用。了解炎症在 CTEPH 中的作用不仅有助于确定最佳治疗方案，还有助于制定未来的预防策略。

05 思考延伸

1、这篇文章很有研究意义；结合目前的研究现状；慢性血栓栓塞性肺动脉高压 (CTEPH) 疾病临床治疗的瓶颈；通过 NF-κB 激活的炎症因子 TNF-α 可能会产生抗凋亡的内皮细胞，导致肺血管重塑。炎症通路的激活，这可能是全身炎症与神经体液激活相结合的结果，提出了对 CTEPH 的新理解；抗炎可能有助于 CTEPH 未来的预防策略。

2、本文的局限性：尽管在本研究中成功建立了大鼠 CTEPH 模型，但并没有从肺动脉中分离肺内皮细胞并进行体外检测。

 

3、了解 PE 如何在人类中转变为 CTEPH，CTEPH 动物模型构建方法；

角叉菜胶：常用作动物急性非特异性炎症模型的致炎剂；

氨甲环酸注射液：适应症为本品主要用于治疗急性或慢性、局限性或全身性原发性纤维蛋白溶解亢进所致的各种出血。