Mesenchymal Stromal Cells Directly Promote Inflammation by Canonical  NLRP3 and Non-canonical Caspase-11 Inflammasomes

间充质基质细胞通过典型NLRP3 和非典型Caspase-11炎症小体直接促进炎症

 

期刊：EBioMedicine

影响因子：6.183

发表日期：2018年5月18日

 

 

 

炎症是机体对于内部或者外部刺激的一种综合性防御反应，虽然炎症是机体的防御性应答机制，但是过强或持续性的炎症反应会使机体免疫应答发生异常，导致非特异性组织损伤，引起一系列的病理反应，如败血症、过敏反应、动脉粥样硬化、结肠炎甚至癌症等。

 

炎症小体是一组细胞内蛋白复合物，是炎症反应的重要参与者，它通过分泌促炎因子，诱导细胞焦亡，发挥炎症免疫应答功能。炎症小体有两条不同的活化通路，即经典炎症小体通路和非经典炎症小体通路；NLRP3 炎症小体是研究较多的炎症小体之一，NLRP3炎症小体包含NLRP3、凋亡斑点蛋白(ASC)和pro-Caspase-1；它的激活促进了 IL-1β 和 IL-18 的成熟与分泌，诱导细胞焦亡，导致细胞内容物的释放，调控炎症反应。Caspase-11 炎症小体属于非经典的炎性小体，可识别胞内 LPS，不受 ASC调节，可自身诱导细胞焦亡，但诱导 IL-1β 和 IL-18 的成熟需要借助于 NLRP3 炎症小体。

 

 

间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)几乎存在于所有类型的组织中，可以分化为不同的细胞类型，如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、细胞等；在治疗炎症疾病方面具有很好的临床应用前景。虽然 MSCs 对炎症疾病有肯定的疗效，但 MSCs 调控炎症的细胞和分子机制并不完全清楚。既往研究表明 MSCs 可以通过与免疫细胞接触或分泌细胞因子参与炎症反应；MSCs 上高表达 TLRs 等重要的炎性受体分子，可将炎症信号转导传递给免疫细胞，但 MSCs 是否能直接调控炎性还不完全清楚。

 

基于间充质基质细胞(MSCs)的治疗炎症性疾病是一种很有前途的治疗方法。因此，非常有必要探讨间充质基质细胞(MSCs)对炎症刺激的反应机制，从而阐明炎症反应的作用机制。

 

 

 

 

 

 

1、Nigericin和LPS激活BA-MSCs体外的NLRP3炎症小体

1.1分组

细胞分组1（n=3）

①对照组：正常大鼠来源BA-MSCs细胞，未做任何处理

②LPS组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h ③LPS+NIG组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h，5mM Nigericin 刺激 BA-MSCs 1.5h

细胞分组2（n=3）

①对照组：NLRP3 基因敲除小鼠来源BA-MSCs细胞，未做任何处理 

②LPS组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h ③LPS+NIG组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h，5mM Nigericin 刺激 BA-MSCs 1.5h

 

1.2 检测内容

①透射电镜 

②免疫荧光共定位：DAPI和GSDMD 

③WB检测：NLRP3/pro-IL-1β/pro-caspase-1等指标 

④ELISA检测：IL-1β 和 IL-18

 

数据表明：LPS和nigericin诱导BA-MSCs中NLRP3炎症小体的活化，IL-1β/18的释放依赖于NLRP3，而pyrptosisis独立于NLRP3。

 

 

2、Caspase-11炎症小体也在BA-MSCs中被Nigericin和LPS激活

 

2.1细胞分组

细胞分组1（n=3）

①对照组：正常大鼠来源BA-MSCs细胞，未做任何处理

②LPS组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h ③LPS+NIG组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h，5mM Nigericin 刺激 BA-MSCs 1.5h

 

细胞分组2（n=3）

①对照组：Caspase-11 基因敲除小鼠来源BA-MSCs细胞，未做任何处理

②LPS组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h ③LPS+NIG组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h，5mM Nigericin 刺激 BA-MSCs 1.5h

 

细胞分组3（n=3）

①对照组：Caspase-1/11 基因敲除小鼠来源BA-MSCs细胞，未做任何处理 

②LPS组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h ③LPS+NIG组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h，5mM Nigericin 刺激 BA-MSCs 1.5h

 

2.2 检测内容

①透射电镜 

②免疫荧光共定位：DAPI和GSDMD 

③WB检测：Caspase11/pro-IL-1β/pro-caspase-1等指标

④ELISA检测：IL-1β 和 IL-18

 

数据表明：用LPS和nigericin刺激也可以激活BA-MSCs中的capase-11炎症小体，从而诱导焦变并促进IL-1β / 18的分泌。此外，BA-MSCs中炎症小体的激活依赖于半胱天冬酶-1/11基因和半胱天冬酶-1基因对IL-1β/18释放的控制。

 

 

3、BA-MSCs的NLRP3和Caspase-11炎症小体在体内被激活

 

3.1动物分组

动物分组1（n=10）

①对照组：正常小鼠，来源BA-MSCs细胞，未做任何处理 

②大肠杆菌（ E.coli）组：模型构建成功后，分离 BA-MSCs 

③铜绿假单胞菌(P.a)组：模型构建成功后，分离 BA-MSCs

动物分组2（n=10）

①对照组：正常小鼠，来源BA-MSCs细胞，未做任何处理 

②硫酸葡萄糖组：模型构建成功后，分离 BA-MSCs

 

3.2 检测内容

①WB检测：NLRP3/Caspase11/pro-IL-1β/pro-caspase-1等指标

②免疫荧光共定位：DAPI/CD51/GSDMD

 

数据表明：规范NLRP3炎症小体被激活以参与IBD小鼠BA-MSCs的炎症反应，而非规范半胱天冬酶-11炎症小体可能不参与。

 

 

4、抑制 BA-MSCs 中 NLRP3 炎症小体可提高其治疗 IBD 的疗效

 

4.1动物分组

动物分组1（n=10）

①PBS组：注射 PBS 的 IBD 小鼠 

②MSC-WT组：模型构建成功后，注射野生小鼠来源的 BA-MSCs 

③MSCs-NLRP3-/-组：注 射 NLRP3 基因敲除小鼠来源的 BA-MSCs

 

4.2 检测内容

①临床评分、结肠长度 

②HE染色 

③荧光显微镜显示 

④流式细胞仪检测分析

 

结果表明：即当对自身组织损伤炎症作出反应时，只有NLRP3炎症小体在BA-MSCs中被激活，这意味着NLRP3基因缺乏通过抑制结肠炎动物的焦变来增强BA-MSC存活率。

 

 

5、一种合成产物（66PR)抑制了骨相关间充质基质细胞中炎症小体的激活

 

5.1细胞分组

细胞分组1（n=3）

①对照组：正常大鼠来源BA-MSCs细胞，未加 66PR 处理组 ②LPS组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h未加 66PR 处理组 

③LPS+NIG组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h，5mM Nigericin 刺激 BA-MSCs 1.5h；未加 66PR 处理组 

④对照组：Caspase-11 基因敲除小鼠来源BA-MSCs细胞，加入 66PR 处理 

⑤LPS组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h；加入 66PR 处理 

⑥LPS+NIG组：加入 500ng/ml LPS 预处理 BA-MSCs 细胞 4h，5mM Nigericin 刺激 BA-MSCs 1.5h；加入 66PR 处理

 

5.2 检测内容

①透射电镜 

②激光共聚焦分析：GSDMD 

③WB检测：Caspase11/pro-IL-1β/NLRP3等指标 

④ELISA检测：IL-1β

 

 

5.3动物分组

动物分组1（n=10）

①PBS组：注射 PBS 的 IBD 小鼠 

②66PR组：模型构建成功后，腹腔注射66PR

 

5.4检测内容

①体重、临床评分、结肠长度

②HE染色 

③免疫荧光共定位 

④WB检测：Caspase1p20/pro-IL-1β/NLRP3等指标

 

 

5.5动物分组

动物分组1（n=10）

①PBS组：经腹腔给 IBD 模型小鼠注射 PBS 

②MSC组：模型构建成功后，腹腔注射正常BA-MSCs 

③66PR组：模型构建成功后，腹腔注射经 66PR 处理的 BA-MSCs

 

5.6检测内容

①体重、临床评分、结肠长度 

②HE染色 

③免疫荧光共定位 

④流式细胞仪检测分析

 

结果表明：66PR可以通过在自身组织损伤炎症环境中抑制焦变来改善BA-MSCs的存活率。

 

 

 

 

一、体外证实 BA-MSCs 中存在 NLRP3 和 Caspase-11 炎症小体

       通过 LPS/Nigercin 刺激野生小鼠来源的 BA-MSCs、NLRP3 基因敲除小鼠和 Caspase-11 基因敲除小鼠和 Caspase-1/11 基因敲除小鼠来源的 BA-MSCs，从炎症小体相关蛋白的表达、细胞因子的分泌、焦亡的发生等方面证实了 BA-MSC 中存在NLRP3 炎症小体和 Caspase-11 炎症小体。

 

二、体内证实 BA-MSCs 中存在 NLRP3 和 Caspase-11 炎症小体

       采用大肠杆菌和铜绿假单胞菌建立小鼠感染性炎症模型，通过炎症小体相关的表达和焦亡的发生，确认感染性炎症刺激，可激活 BA-MSCs 中 NLRP3 炎症小体和 Caspase-11 炎症小体。利用 DSS 建立了 IBD 模型小鼠，发现 IBD 可激活 MSCs中 NLRP3 炎症小体，不能激活 Caspase-11 炎症小体。

 

三、新型小分子化合物 66PR 可抑制 BA-MSCs 中炎症小体

      为了调控 BA-MSCs 中炎症小体的活性，寻找 BA-MSCs 中炎症小体的抑制剂。通过体内外研究证实小分子化合物 66PR 可抑制 BA-MSCs 中炎症小体的激活。将 66PR 处理的 BA-MSCs 移植到 IBD 小鼠，可提高其治疗炎症性疾病的效果。

 

四、 骨相关 MSCs 的表面标记    

        本研究采用的 BA-MSCs 来源于小鼠长骨，经流式细胞仪分析发现 CD44、CD51、CD90、 CD105、 CD146、 CD166 和 Sca1 表面标记均呈阳性，因此骨BA-MSCs 具有间充质基质细胞的通用标记；免疫细胞常见的表面分子标记 CD11c、CD11b、F4/80、Gr1、CD14、CD3 和 CD19 均呈阴性，说明 BA-MSCs中包含的免疫细胞数量极低；这些对我们提取和鉴定此类细胞具有重要的参考价值。

 

五、创新性

        本研究确定BA-MSCs通过炎症小体信号转导直接参与炎症反应，并补充了非免疫细胞中炎症小体激活的知识。这些发现提醒我们，维持适当的炎症平衡不仅应该包括靶向免疫细胞，还应该包括靶向非免疫细胞。扩展了我们对BA-MSCs的微妙功能的理解，除了造血或组织修复，这对BAMSCs在临床环境中的使用很重要。

本研究采用新型小分子化合物 66PR 对 BA-MSCs 的促炎特性进行抑制，以提高 BA-MSCs在 IBD 治疗中的治疗效果；该发现具有较高的市场价值。

 

 

 

 

 

以上文献涉及的实验技术，均可在晶莱生物展开。

 

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