MarvelD3 Is Upregulated in Ulcerative Colitis and Has Attenuating Effects during Colitis Indirectly Stabilizing the Intestinal Barrier

MarvelD3在溃疡性结肠炎中上调，在结肠炎期间具有减弱作用，间接稳定肠道屏障

 

期刊名：cells；

影响因子：6.9

 

 

研究背景&意义

 

1、炎症性肠病 (IBD) 包括溃疡性结肠炎 (UC) 和克罗恩病 (CD)，是一组慢性特发性复发和缓解的胃肠道自身免疫性疾病，其发病率在几十年内不断增加。尽管 IBD 几乎可以发生在任何年龄，但大多数患者在 30 岁到 40 岁之间得到诊断。由于缺乏治愈方法，IBD 的治疗旨在获得和维持缓解，并预防并发症。

2、在炎症性肠病（IBD）中，肠道屏障受损的主要特征是紧密连接蛋白表达的改变。紧密连接相关的 MARVEL 蛋白 MARVELD3 (MD3) 在 IBD 中的功能作用尚不清楚。

3、IBD 的形成一般是多种因素导致的，如环境、感染、免疫害以及遗传因素。表现涉及肠道屏障的失调以及粘膜免疫反应的增强。对肠上皮屏障来说，特别重要的是紧密连接(TJ)。TJ是由位于上皮细胞之间的多蛋白复合物构建的，位于最顶端，形成细胞-细胞连接，收紧细胞旁间隙并调节跨上皮通道和屏障特性。有两 种类型的TJ，即形成的双细胞TJ4、在一些实验性的AKI模型中，n3-PUFA的使用与肾功能的改善相关。

4、TJ的跨膜蛋白可以分为四个家族：a、claudin 家族，包括哺乳动物中的 27 个成员；b、连接粘附分子；c、angulin 家族，包括 angulin-1、-2 和 -3 三个成员；d、TJ 相关 MARVEL蛋白 (TAMP)，包括 occludin 、三纤维素和MARVELD3；

5、对于MARVELD3(MD3)，我们还不知道IBD的潜在变化和功能。它被描述为存在于两个剪接变体MD3v1和MD3v2中的TJ蛋白，它们在屏障形成方面的功能尚不明确，似乎在TJ稳定、细胞行为和生存以及发育中更相关。 

 

研究意义：由于这些因素也可能是可能在IBD受损上皮中发挥作用的因素，所以作者研究过对MD3在IBD中的潜在变化和调节过程。

 

 

技术路线

 

 

 

研究内容

 

（1）临床样本：

8例CD患者（乙状结肠检测有炎症）、8例UC患者和8例接受结肠镜检查的无肠道疾病患者（健康对照）。进行乳糜泻内镜评分(SES-CD)；是一种用于乳糜泻患者内镜表现分期的评分系统。该评分考虑了粘膜溃疡的数量和大小，受影响的程度和溃疡表面的程度，以及是否存在狭窄的肠腔。同时进行了Mayo内窥镜亚评分，这个评分用于获取结肠镜检查期间的疾 病表现，用于UC患者。在这里，2到5分表示为轻度，高于6分表示中度至重度疾病活动。

 

（2）细胞实验：

a、人结肠细胞系 HT-29/B6 ；细胞因子处理细胞；进行基础检测。

b、细胞验证实验：细胞+抑制剂+细胞因子；进行基础检测。

 

（3）动物实验：

① 构建MD3过表达小鼠：针对该区域的载体构建包含了一个egfp标记版本的小鼠MD3的编码序列，并允许在 crea-重组酶的控制下诱导表达。此外，我们还引入了一个cag启动子，以允许不同的表达强度；将该载体构建物注射到Villin-Cre小鼠[27]的受精卵中。来自这些细胞的小鼠与表达 Villin-Cre重组酶的小鼠杂交，以产生肠上皮细胞过表达GFP标记的MD3的小鼠。这些小鼠与 C57Bl/6NCrl进行10代繁育，并对Cre进行基因分型和GFP作为外源MD3的标记，用于确认引入基因的表达。

② 结肠炎造模：实验中使用的动物为来自杂合子育种的雄性小鼠（12周龄），并以基因典型的野生型同窝小鼠作为对照。小鼠在标准化条件下饲养。右旋糖酐硫酸钠(DSS)用于诱导结肠炎。饮用水中3%的DSS的量被自由给予超过5天。对照组小鼠接受相同的水，没有DSS。

 

研究结论及分析

 

1、临床样本评分：

 

2到5分表示为轻度，高于6分表示中度至重度疾病活动。

 

 

2、 MD3在IBD患者肠上皮中的表达

 

对 IBD 患者和健康对照的膜蛋白组分的分析显示，MD3 v1 在 UC 中上调（对照：100.0 ± 10.4%，UC：259.9 ± 51.3%），但仅显示 CD 增加的趋势（CD：120.6 ± 1.7 %，p = 0.069)，而 MD3v2 不受影响（对照：100.0 1.1%，CD：97.2 11.1%，UC：84.3 8.0%；图2一种）。

此外，与对照相比，CD 或 UC 患者中 MD3 的定位没有改变，如免疫荧光染色所示（图B).

 

 

3、 参与MD3上调的信号通路

 

为了分析UC中MD3增加的原因因素，作者检测了IBD中几种相关的细胞因子，特别是UC对 MD3表达的影响。

为此，作者使用了人结肠上皮细胞系HT-29/B6。用表2中列出的细胞因子处理 细胞48小时(或用TNF处理24小时)。关于 IL-4，UC 的变化存在争议，因为有下调的报道;因此，重点放在了 IL-13 上。

 

 

测试表明，IL-4和IL-13是最有希望参与UC中MD3 上调的候选基因(图A)。

STAT6 抑制剂 SAHA 和 STAT3 抑制剂抑制剂 VI 和 AG490 能够抑制 IL-13 对 MD3 表达的影响，表明这两种 STAT 参与。

 Tanshinone IIa 部分降低了 IL-13 的作用，表明转录 AP-1 可能参与 MD3 表达，但不是主要参与者。MAPK/Erk 通路 (U0126)、JNK (JNKV 和 SP600125) 和 JAK3 的抑制仍导致 MD3 表达增加。这些结果指向 STAT3/6 调节的信号传导，该信号已被描述为通过 IL-13 与 IL-13Rα1 的结合而启动。

 

 

3.MD3 在 DSS 诱导的结肠炎中的作用

 

为了分析 MD3 在结肠炎中的作用，产生了在 Villin-Cre 启动子控制下肠道过表达 MD3 (MD3-OE) 的小鼠。小鼠与wt小鼠无明显表型差异，发育正常。

在雄性 12 周龄小鼠中通过饮用水应用 DSS 诱发结肠炎。

 

与 DSS 野生型 (wt) 小鼠相比，DSS MD3-OE 小鼠的结肠炎严重程度较低（DAI 较低）（图A），这是基于血便和水样便的发生率较低，但不是体重减轻。

结肠长度（图B) 与各自的对照相比，wt DSS 和 MD3-OE DSS 均降低，而 wt 和 MD3-OE 小鼠的结肠长度或宽度之间没有显着差异。

此外，结肠的组织学外观在任何情况下都没有显着差异（图C）。

在 wt 和 MD3-OE 中，DSS 处理导致隐窝结构扭曲、表层上皮衬里缺失和免疫细胞浸润。然而，在 MD3-OE 动物中，这些变化的程度似乎不太明显，这与它们的粪便外观一致（图C）。

 

 

与wt小鼠相比，这些MD3-oe小鼠中MD3的表达大约增加了一倍(图5A)。肠内其他TJ蛋白的 表达没有变化。只有occludin的表达增加，由于巨大的变化，这并不显著(图B，C)。

在wt和MD3-OE中，一些TJ蛋白的表达水平受到DSS的影响(图B，C); 对于claudin-1，与 对照条件下的低表达量相比，测量到的增加变化很大，使得这些变化不显著。Claudin-4也有增加的趋势(也有ns)，但不如Claudin-1明显。

在DSS的影响下，claudin-15和三细胞蛋白明显下调, 在DSS下，wt小鼠的MD3表达上调，与对照条件下MD3-oe小鼠的水平相当(图B，C)。在这些小鼠中，DSS下MD3没有进一步增加。

 

 

利用单向阻抗谱对结肠组织进行电生理屏障检查(图A)，结果显示，在稳态条件下，WE和 MD3-OE的屏障性能没有差异。

在wt和MD3-OE小鼠 和dssin诱导的结肠炎小鼠中，HRP的通透性不受影响(图C)。 

此外，我们还分析了不同大小的细胞旁通量标记物。荧光素是一种332Da的小通量细胞旁 标记物，在dss诱导的结肠炎中，仅在wt小鼠中倾向于增加，而这种趋势在MD3-OE小鼠中不可见 。然而，两者之间并没有明显的差异(图D)。

对于大分子4kDaFITC-右旋糖酐(FD4图E)，细胞 旁通透性增加.在 DSS 诱导的结肠炎期间，wt 小鼠和 MD3-OE 小鼠彼此之间没有差异。

 10 kDa FITC-葡聚糖也观察到了类似的增加（FD10 图F）。有趣的是，未处理的 MD3-OE 小鼠对 FD10 的渗透性已经明显高于 wt 小鼠。然而，与结肠炎小鼠的增加相比，这仍然处于较低的范围内。

 

 

文献总结

 

该研究揭示了 UC 患者中 MD3 v1 的上调，并将 IL-13 确定为该效应的调节细胞因子。这种调节是通过激活涉及 STAT3 和 6 的 IL-13Rα1 依赖性途径来实现的。MD3 在小鼠中的过表达对 DSS 诱导的结肠炎具有保护作用；然而，这些结果背后的机制需要进一步研究。

然而，这些发现支持我们之前在 UC 治疗中靶向 IL13Rα2 受体的建议，因为这将抑制 IL-13 诱导的三纤维素下调，同时允许 claudin-2 和 MD3 的上调，从而稳定上皮屏障。

 

 

文献涉及的实验技术

 

 

 

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