Tankyrase Inhibitors Target Colorectal Cancer Stem Cells via AXIN-Dependent Downregulation of c-KIT Tyrosine Kinase

端锚聚合酶抑制剂通过AXIN依赖性下调c-KIT酪氨酸激酶来靶向抑制结直肠癌干细胞

 

 

发表时间：2020年

影响因子：5.268

 

 

研究背景

 

结直肠癌

结肠直肠癌是世界上第四大导致癌症相关死亡病因。对于复发和转移性结直肠癌的治疗，常规细胞毒性药物和分子靶向药物可作为标准治疗。然而，结直肠癌的完全根除受到这些肿瘤内在和获得性耐药性的阻碍。

 

结直肠癌中肿瘤干细胞

肿瘤组织包含异质的癌细胞群，其中包括被称为癌症干细胞(CSC)的亚群，具有高度的致瘤潜能。CSCs对化疗和放疗有耐药性，可导致疾病复发。结直肠癌中，表达干细胞相关细胞表面抗原的癌细胞亚群，如CD44和Lgr5，具有csc样特性。

 

端锚聚合酶

端锚聚合酶参与多个生物过程，如端粒伸长、有丝分裂和细胞运动，端锚聚合酶也是Wnt/b-连环蛋白信号通路的正调控因子，该通路在结直肠肿瘤发生的早期阶段上调。

 

c-KIT

c-KIT(CD117)是一种受体酪氨酸激酶，可被其配体干细胞因子（SCF）激活。scf结合的c-KIT导致其自磷酸化，并随后激活下游的MAPK和mTOR信号通路。已有研究表明，c-KIT与胃肠道间质瘤、白血病、结直肠癌和黑色素瘤肿瘤生长有关。在结直肠癌中，一个c-kit阳性癌细胞亚群表现出高致瘤潜能。

 

 

技术路线

 

 

 

研究结果及分析

 

3.1.1  结直肠癌肿瘤干细胞分选鉴定

 

A，流式细胞术检测colo-320DM细胞中cd44阳性细胞。B，coloo-320DM细胞中CD44的免 疫荧光染色。

C，从coloo-320DM细胞中分离出的cd44阳性和-阴性细胞。

D，C的细胞皮下注射到NOD-SCID小鼠(10 3每只小鼠的细胞，n¼6)。

 

裸鼠体内成瘤实验，CD44+细胞比CD44-细胞更易成瘤。

 

 

3.1.2  结直肠癌肿瘤干细胞分选鉴定

 

E，通过qRT-PCR检测肠干细胞标志物(Lgr5、LRIG1、CDCA7和RNF43)和分化标志物(CEACAM1和KRT20)的RNA表达。

 

CD44+细胞干细胞标志物表达更高，分化标志物表达相对较低。

 

 

3.1.3  结直肠癌肿瘤干细胞分选鉴定

 

F，Colo-320DM细胞分别用SN38 或5-FU处理7天，并进行低细胞术。

 

常规抗癌药物处理后，CD44+细胞比例升高，CD44+肿瘤干细胞是产生耐药性原因。

 

 

3.2.1  靶向CSCs CD44+Cell药物筛选

 

A，Colo-320DM细胞进行FACSAria细胞分选，将得到的cd44阳性和-阴性细胞组分分别用IWR-1和G007-LK处理5天。

 

TNKS（端锚聚合酶）抑制剂可作为CSCs苗头化合物，IWR-1、G007-LK对cd44阳性细胞生长的抑制作用强于cd44阴性细胞。

 

 

3.2.2  靶向CSCs CD44+Cell药物筛选

 

TNKS（端锚聚合酶）抑制剂可作为CSCs苗头化合物，IWR-1、G007-LK对cd44阳性细胞生长的抑制作用强于cd44阴性细胞。

 

 

3.2.3  靶向CSCs CD44+Cell药物筛选

 

TNKS（端锚聚合酶）抑制剂可作为CSCs苗头化合物，IWR-1、G007-LK对cd44阳性细胞生长的抑制作用强于cd44阴性细胞。

 

 

3.3.1  TNKS抑制剂对cd44+结直肠癌细胞的优先抑制作用依赖于AXIN2的积累，不依赖b-catenin下调

 

抗癌药物处理后下游通路AXIN、b-catenin表达变化。

 

 

3.3.2  TNKS抑制剂对cd44+结直肠癌细胞的优先抑制作用依赖于AXIN2的积累，不依赖b-catenin下调

 

B，cd44阳性和阴性的colo-320DM细胞中B-Catenin敲低。

C，与B一样转染细胞，转染120小时后检测细胞生长情况。

D，cd44阳性和阴性 的colo-320DM细胞用FH535处理120小时，用MTT法定量。

 

TNKS抑制剂对cd44+结直肠癌细胞的优先抑制作用不依赖b-catenin下调。

 

 

3.3.3  TNKS抑制剂对cd44+结直肠癌细胞的优先抑制作用依赖于AXIN2的积累，不依赖b-catenin下调

 

E、cd44阳性和-阴性的Colo-320DM细胞转染对照或AXIN2siRNA。

F，CellsweretransfectedasinE，用G007-LKs处理120小时，并定量测定细胞数量。

 

TNKS抑制剂对cd44+结直肠癌细胞的优先抑制作用依赖于AXIN2的积累。

 

 

3.4.1  TNKS抑制剂通过下调c-KIT抑制cd44阳性结直肠癌细胞

 

 

A，cd44阳性的Colo-320DM细胞中胚胎干细胞相关基因(在V6.5胚胎干细胞胚状体分 化的早期阶段下调的基因)的富集。

B，qRT-PCR检测cd44阳性和阴性Colo-320DM细胞中cKITmRNA的表达。C，Westernblot检测c-kit蛋白的表达。

D，细胞对伊 马替尼的敏感性。

 

CD44+/-结直肠癌细胞中c-KIT具有表达差异。

 

 

3.4.2  TNKS抑制剂通过下调c-KIT抑制cd44阳性结直肠癌细胞

 

 

 

3.5.1  Colo-320DM细胞的CD44/c-kit双阳性亚群在体内具有很高的肿瘤起始潜能

 

CD44/c-kit双阳性细胞比cd44阳性/c-kit阴性细胞更具有致瘤性。

 

 

3.6.1  AXIN2下调SP1转录因子募集到c-KIT启动子影响其表达

 

A，烷基酶抑制剂对c-KIT蛋白的下调依赖于AXIN2。用对照或AXIN2siRNA转染细胞48小时，然后用DMSO或烷基酶抑制 剂处理5天。裂解物进行蛋白印迹分析。

 

 

3.6.2  AXIN2下调SP1转录因子募集到c-KIT启动子影响其表达

 

B，烷基酶抑制剂对c-KITmRNA的下调依赖于AXIN2。

C，tankyr酶抑制剂以AXIN2依赖的方式下调c-KIT启动子活性。

D，tankyr酶抑制剂抑制SP1招募到c -KIT启动子。

E，在g007-lk处理的细胞中，AXIN2敲低对SP1招募到c-KIT启动子的影响。

 

 

3.7.1  TNKS（端锚聚合酶）抑制剂联合抗癌药物具有更高效CSCs抑制活性

 

体外实验表明联合给药具有更高效CSCs抑制活性。

 

 

3.7.2  TNKS（端锚聚合酶）抑制剂联合抗癌药物具有更高效CSCs抑制活性

 

C，G007-LK和伊立替康联合治疗小鼠异种移植物。

D，C组第22天的小鼠。E，烷基酶抑制剂的作用示意图模型。

 

体内裸鼠成瘤实验表明联合给药具有更高效CSCs抑制活性。

 

 

文献总结

 

TNKS（端锚聚合酶）抑制剂可作为cd44阳性结直肠CSCs的治疗靶点。

 

c-KIT的表达与cd44阳性Colo-320DM细胞的肿瘤起始潜能相关，提示c-KIT是结直肠CSCs的治疗靶点。

 

TNKS抑制剂调控的Wnt/b-catenin信号对维持肠隐窝很重要，毒性可能限制其临床应用，这个问题可以通过发挥协同作用的联合治疗来克服。

 

 

文献涉及的实验技术

 

 

 

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