SSRP1promotescolorectalcancerprogressionandis negativelyregulatedbymiR‐28‐5p

 

（SSRP1促进结直肠癌进展，并受到miR-28-5p的负调控）

 

期刊：J Cell Mol Med

影响因子：5.310

发表日期：2019年

 

 

 

结直肠癌（CRC）是最常见的诊断癌症之一，也是全世界癌症死亡的主要原因之一。结直肠癌通常在晚期诊断，伴有转移，与患者生存率呈负相关，并且结直肠癌仍然无法治愈。因此，迫切需要发现新的诊断和预后标志物，更好地理解结直肠肿瘤发生和转移的分子机制。

 

结构特异性识别蛋白1（SSRP1）是组蛋白伴侣促进染色质转录（FACT）复合物的亚单位，参与几乎所有染色质相关过程，包括DNA复制、修复和转录，在维持未分化细胞状态中起主要作用。此外，SSRP1在各种肿瘤中表达上调，如乳腺癌和卵巢癌，并且与较差的预后相关。

 

SSRP1的一种抑制剂CBL013通过阻断SSRP1依赖性p53激活以及下调一部分核因子-κB（NF-κB）依赖性基因导致细胞凋亡。这些结果表明SSRP1是癌症治疗的潜在靶点。然而，SSRP1在大肠癌中的作用、机制和临床价值尚不清楚。

 

 

 

 

 

一、检测结直肠癌（CRC）组织和相应正常组织中SSRP1的表达水平

 

（1）微阵列数据分析

 

我们首先分析了来自两个独立数据集GSE32323和GSE4107的结直肠癌患者中SSRP1mRNA的表达。这两个数据集包括成对的大肠癌肿瘤和相邻的非癌组织的mRNA信息。如图1A所示，人类结直肠肿瘤组织中的SSRP1mRNA水平显著高于相邻正常结直肠组织中的水平。

 

 

（2）qRT-PCR实验

 

为了验证微阵列分析结果，我们对人结直肠腺癌标本及其配对正常组织进行了qRT-PCR实验。与各自匹配的正常组织相比，10个肿瘤样本中有9个显示SSRP1mRNA水平升高（图1B）。

 

 

（3）免疫组化实验

 

 

为了进一步研究SSRP1与大肠癌进展之间的关系，我们还测量了80例人类大肠癌组织样本及其配对正常组织中SSRP1的表达水平。SSRP1位于细胞质和细胞核中（图1D，E），这与先前报告的结果一致。

 

如图所示，SSRP1在大多数（85%，68/80）大肠癌标本中上调（图1F）。

这些数据清楚地表明SSRP1在大肠癌中的mRNA和蛋白质水平上调，这暗示了SSRP1在大肠癌发病机制中的重要性。

 

 

（4）SSRP1表达水平与疾病进展和患者生存期缩短相关

 

为了证实结直肠癌中SSRP1表达水平与临床病理因素之间的相关性，下载GSE14333的临床信息并进行统计分析。然后根据肿瘤组织中SSRP1的表达水平将数据集中的样本分为两组，并应用卡方检验。如表1所示，较高的SSRP1表达水平与Dukes期密切相关（P=0.003）。结果表明，SSRP1的高表达与肿瘤的快速扩散有关。重要的是，结果显示，SSRP1高表达肿瘤的大肠癌患者的DFS和RFS明显短于SSRP1低表达肿瘤的患者（图S1A，B）（分别为P=0.0025和P=0.019）。

 

这些发现强烈提示：SSRP1可能是大肠癌的一个新的预后因素。

 

 

二、细 胞 实 验

 

（1）siRNA干扰

 

 

 为了验证SSRP1在结直肠癌细胞增殖中的生物学作用，我们使用三种siRNA在HCT116和SW480细胞中去除SSRP1。在将三个siRNA转染到CRC细胞后，我们使用Western blot分析来测量SSRP1蛋白水平。图S2A显示，与对照siRNA相比，所有靶向siRNA在两个细胞系中都能有效地敲除SSRP1；siRNA-2是最有效的。

       因此，选择该siRNA-2进行后续验证。SSRP1在HCT116细胞系中通过慢病毒介导的pLV-SSRP1质粒稳定过度表达，与其他CRC细胞系中的表达相比，HCT116细胞系中的SSRP1表达水平相对较低。SSRP1在细胞中的表达通过荧光显微镜、免疫印迹和qRT-PCR进行验证（图S2B-D）。

 

 

（2）CCK8检测细胞增殖

 

正如所料，SW480（图S3A）和HCT116细胞（图2A）中的SSRP1 siRNA干扰显著抑制了细胞增殖，而HCT116细胞中的SSRP1过度表达增强了细胞增殖（图2A）。

 

 

（3）流式分析细胞周期

 

细胞增殖在很大程度上取决于细胞周期进程。因此，流式细胞术也评估了SSRP1基因敲除对细胞周期过程的影响。用si-SSRP1或对照siRNA处理48小时后，收集细胞并用PI染色。SSRP1基因敲除导致HCT116（图2D）和SW480细胞中G0/G1期细胞明显聚集，S/G2/M期细胞比例显著降低（图S3B）；相反，SSRP1的过度表达促进了HCT116细胞的细胞周期进程（图2E）。

 

这些数据表明：SSRP1调节细胞周期。

 

 

（4）WB检测

 

p53是一种关键的细胞周期调节因子。如图2F所示，我们测定了SSRP1基因敲除后的p53表达水平，发现SSRP1基因敲除导致p53蛋白水平升高。我们进一步研究了几种p53下游细胞周期相关分子，发现在HCT116细胞中SSRP1基因敲除后，p21和p27表达上调。在SSRP1敲除细胞中，细胞周期蛋白D1和14-3-3（受p21负调控的细胞周期蛋白）的表达水平降低。此外，SSRP1的过度表达具有相反的效果。  

 

这些结果表明SSRP1调节p53及其相关下游分子。SSRP1对p53通路的调控可能是SSRP1介导的大肠癌细胞周期进程的潜在机制。

 

 

（5）transwell分析

 

SSRP1在癌症转移中的作用尚未得到很好的描述。我们通过transwell分析确定SSRP1是否是影响细胞迁移和侵袭的关键分子。如图所示，敲除SSRP1可抑制SW480和HCT116细胞的迁移和侵袭率（图3A，B）；相反，SSRP1的强制表达对HCT116细胞有相反的影响（图3C）。 结果表明：SSRP1的表达水平与细胞迁移和侵袭呈正相关。

 

 

 VEGF和MMP9是癌细胞侵袭和转移的关键蛋白，癌细胞自分泌这些细胞因子严重影响癌细胞的行为，例如侵袭。当SSRP1在HCT116细胞中被敲除时，MMP9和VEGF被下调（图3D），而在SSRP1过度表达的细胞中则出现相反的调节。

上皮-间充质转化（EMT）在癌症进展和转移中起着重要作用。鉴于SSRP1促进大肠癌细胞系的迁移和侵袭，我们接下来测试SSRP1是否影响大肠癌中的EMT过程。与我们的假设一致，在稳定的SSRP1过表达HCT116细胞中，上皮标记物 ZO-1和E-cadherin的蛋白表达水平明显降低；相反，间充质标记物Snail、Slug、ZEB1、ZEB2、N-钙粘蛋白和Twist的表达水平显著增加（图3D）。通过SSRP1基因敲除HCT116细胞获得了相应的结果（图3D）。

 

结果表明：SSRP1有助于促进结直肠癌细胞中EMT的表达，这至少部分解释了SSRP1过度表达促进结直肠癌细胞转移和侵袭的原因。

 

 

许多癌基因或肿瘤抑制基因在肿瘤发生过程中被解除调控，从而导致异常的细胞生物学特性，使癌细胞具有生长优势。糖酵解和线粒体生物发生的增加是癌症中最显著的代谢改变。ECAR是糖酵解的指标，OCR是线粒体呼吸的指标。因此，还评估了SSRP1对ECAR和OCR的影响。根据ECAR和OCR，与模拟处理和对照细胞相比，SSRP1过度表达的CRC细胞显示出更高的糖酵解率和更高的线粒体呼吸比率，而SSRP1敲除具有相反的效果（图S4A，B）。

 

这些数据表明：SSRP1通过促进CRC细胞的运动和增加糖酵解和有氧氧化促进恶性进展。

 

 

在探索SSRP1在结直肠癌细胞生长和转移中的作用后，我们试图确定SSRP1是否可用于临床结直肠癌治疗。化疗是治疗大肠癌的重要策略。然而，原发性和继发性耐药性是基础和临床研究中的一个重大挑战，在许多情况下，这大大降低了治疗的抗肿瘤效果。我们首先确定了SSRP1在顺铂治疗前后对细胞凋亡的影响。在这两种情况下，SSRP1基因敲除显著增加了凋亡SW480（图4A）和HCT116（图4B）细胞的数量。SSRP1对大肠癌细胞凋亡的负面影响促使我们假设SSRP1也可能与大肠癌细胞的耐药性有关。因此，我们在SSRP1敲除组和对照组中测定了两种细胞系对两种最常用化疗药物顺铂和5-氟尿嘧啶的化疗敏感性。结果显示，在SSRP1基因敲除的两个CRC细胞系组中，两种化疗药物的IC50值均显著降低（图4C）。

 

这些数据表明：SSRP1有益于降低结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性。

 

 

细胞凋亡与凋亡相关基因（包括Bcl-2）的调控密切相关。为了确定SSRP1调节细胞凋亡和化疗耐药的机制，通过Western blotting检测SSRP1敲除或稳定过度表达的HCT116细胞中凋亡相关蛋白的表达。如图S5所示，si-SSRP1转染诱导Bax（一种指示促凋亡表型的分子）的表达，并降低Bcl-2（一种指示抗凋亡表型的分子）的表达。相反，SSRP1过度表达对HCT116细胞有相反的影响。

 

结果表明：SSRP1通过促进细胞凋亡来促进结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性。

 

 

miRNAs在基因表达调控中起着重要作用。确认一种特定的miRNA是否能调节大肠癌中SSRP1的表达将是一件有趣的事情。预测了针对SSRP1 3UTR的潜在miRNA，并通过TargetScan、miRanda和miRwalk分析了其靶位点。为了减少假阳性，只有在三种方法都能预测的情况下，才会考虑候选人。通过这种方法确定的一个候选基因是miR-28-5p，它有一个位点与SSRP1的3UTR互补（图5A）。已经证实，在大肠癌中miR-28-5p下调；我们还通过分析GSE数据集验证了这一点（图5B）。

 

 

  此外，miR-28-5p的过度表达抑制了CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。重要的是，Kaplan-Meier生存分析表明，具有低miR-28-5p表达水平的肿瘤的CRC患者的DFS时间明显短于具有高miR-28-5p表达的肿瘤的患者（图5C）（P=0.015）。因此，我们提出SSRP1的过度表达部分归因于miR-28-5p的下调。转染miR-28-5p后，我们观察到SW480和HCT116细胞中SSRP1蛋白水平降低（图5D）。我们发现miR-28-5p可以抑制HEK293T细胞中SSRP1的报告基因活性；

 

此外，当使用突变质粒（MT质粒）时，抑制作用较弱（图5E）。这些数据表明SSRP1是miR-28-5p的直接靶点。在大肠癌样本中，miR-28-5p和SSRP1表达水平之间也观察到负相关（图5F；P<0.0001，R=−0.731)。

 

这些数据支持SSRP1表达受CRC中miR-28-5p负调控的观点。  

 

三、动 物 实 验

 

  为了验证SSRP1在体内对大肠癌进展的影响，我们使用稳定转染SSRP1过表达慢病毒或对照慢病毒的HCT116细胞进行异种移植肿瘤检测。我们发现SSRP1的慢病毒表达导致异种移植肿瘤的加速生长（图2B，C）。这些数据共同证明SSRP1表达与CRC细胞增殖密切相关。

 

 

 

本文发现在大肠癌组织中SSRP1mRNA水平显著增加。还证实，这种上调与结直肠癌患者的晚期肿瘤阶段有关，SSRP1的高表达水平预示着更短的无病生存期和更快的复发。我们还发现SSRP1调节了大肠癌的增殖、转移、细胞能量代谢和上皮-间质转化。

 

此外SSRP1诱导的凋亡和SSRP1基因敲除增强了结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性。此外，我们还探讨了导致大肠癌中SSRP1失调的分子机制，并鉴定了 microRNA-28-5p（miR-28-5p）作为SSRP1的直接上游调节因子。我们得出结论，SSRP1促进CRC进展，并受到miR-28-5p调控。

 

 

 

 

以上文献涉及的实验技术，均可在晶莱生物展开。

 

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